Gli obblighi a cui erano sottoposti gli ebrei erano molteplici: in pratica era loro vietato di esercitare qualunque mestiere che non fosse quello di usura (ai cristiani era vietato prestare soldi ad interesse) e quello di straccivendoli.
Non potevano vendere roba nuova né costruita da loro ma solo roba vecchia riparata.
Dovevano rientrare nel ghetto prima del tramonto e da loro dovevano essere pagati i gendarmi a guardia delle porte.
Erano inoltre obbligati ad ascoltare ogni sabato una predica nella chiesa di San Gregorio e pare che, per non ascoltare le parole del predicatore, si mettessero dei tappi di cera nelle orecchie.

     Montaigne, in visita a Roma nel 1580, testimonia le condizioni in cui la popolazione era costretta a vivere: vie strettissime, prive di luce, il lerciume ovunque, le abitazioni tramezzate per far spazio a tutti, le malattie per la mancanza di igiene.
A tutto questo si aggiungevano le periodiche inondazioni del Tevere, sorgendo il ghetto nella parte più bassa del suo corso, che regolarmente inondavano i piani più bassi delle case.

     Così il grande umanista Gregorovius descrive la sua visita al Ghetto dopo una di queste inondazioni:
" Quando visitai il Ghetto, il Tevere era straripato e le sue acque giallastre scorrevano per la fiumara fino all'Arco di Ottavia invadendo le stanze e i piani inferiori. Che visione malinconica vedere il misero quartiere ebraico immerso nelle torbide acque del Tevere!" "...osservavo talvolta con sentimento di pena questi esseri pallidi, sofferenti, curvi...!"

     Gregorovius paragona la ristrettezza e il sudiciume del ghetto con le grandi e sontuose dimensioni delle architetture di Roma e commenta:
"...gli unici resti viventi dell'antica Roma, uomini con cuori che hanno molto sopportato, abitano nel sudiciume più infame".
Nel 1656 la peste infierisce fra la già stremata popolazione ebraica del Ghetto e si porta dietro 800 vittime sulle poco più di 4000 che lo popolavano.